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Die Autoren einer kleinen Universitätsstadt mit 20.000 Einwohnern berichten von einer 23 jährigen Frau mit HJMD,
schlechtem Sehvermögen und einer stark geschädigten Netzhaut.
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The first reported case of CDH3-related hypotrichosis with juvenile macular dystrophy from Jordan: a case report

Originalartikel als Download:
PIIS235239642100308X

Übersetzung:

Translationales Durchlesen der Ciliopathie-Gene BBS2 und ALMS1 stellt Protein, Ziliogenese und Funktion in Patientenfibroblasten wieder her

Jonathan Eintracht

Elisabeth Forsythe

Helen May-Simera

Mariya Moosajee

Freier ZugangVeröffentlicht:05. August 2021DOI:https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2021.103515

Abstrakt

Hintergrund

Ziliar dysfunktion liegt einer Reihe von genetischen Störungen zugrunde, die zusammen als Ziliopathien bezeichnet werden und für die es keine Behandlungen gibt. Das Bardet-Biedl-Syndrom (BBS) ist durch eine multisystemische Beteiligung gekennzeichnet, einschließlich Stäbchen-Zapfendystrophie und Nierenanomalien. Zusammen mit dem Alström-Syndrom (AS) werden sie aufgrund ihres gemeinsamen Phänotyps als "Adipositas-Ciliopathien" bezeichnet. Nonsense-Mutationen sind für etwa 11% bzw. 40% der BBS- und AS-Fälle verantwortlich. Translationale Readthrough-induzierende Medikamente (TRIDs) können Proteine in voller Länge wiederherstellen, indem sie vorzeitige Terminierungscodonons im Rahmen umgehen, und sind ein potenzieller therapeutischer Ansatz für Nonsense-vermittelte Ciliopathien.

Methodik

Patientenfibroblasten, die Nonsense-Mutationen von zwei verschiedenen Ciliopathien (Bardet-Biedl-Syndrom und Alström-Syndrom) aufwiesen, wurden mit PTC124 (Ataluren) oder Amlexanox behandelt. Nach der Behandlung wurden genexpression, Proteinspiegel und Ziliogenese bewertet. Die Expression des intraflagellaren Transportproteins IFT88 und des G-Protein-gekoppelten Rezeptors SSTR3 wurde als Ablesung der Ziliarfunktion untersucht.

Befund

Die mRNA-Expression war in mit Amlexanox behandelten Patientenfibroblasten signifikant erhöht, und die BBS2- oder ALMS1-Proteinexpression in voller Länge wurde in PTC124- und Amlexanox-behandelten Fibroblasten wiederhergestellt. Die Behandlung mit TRIDs verbesserte signifikant die Ziliogenesedefekte in BBS2Y24*/R275*-Fibroblasten. Die Behandlung stellte die IFT88-Expression wieder her und korrigierte die SSTR3-Fehllokalisation in BBS2Y24*/R275* und ALMS1S1645*/S1645* Fibroblasten, was auf eine Rettung der Ziliarfunktion hindeutet.

Auslegung

Die Wiederherstellung der BBS2- und ALMS1-Expression in voller Länge und die Korrektur anatomischer und funktioneller Ziliardefekte in BBS2Y24*/R275* und ALMS1S1645*/S1645*-Fibroblasten legen nahe, dass TRIDs eine potenzielle therapeutische Option für die Behandlung von Nonsense-vermittelten Ziliopathien sind.

Finanzierung

Wellcome Trust 205174/Z/16/Z, Nationales Zentrum für den Ersatz, die Verfeinerung und die Reduzierung von Tieren in der Forschung. Deutsche Forschungsgemeinschaft SPP2127 (DFG Grant MA 6139/3-1).

Schlüsselwörter

Unsinnige Unterdrückung

Ziliopathien

Ataluren |

Amlexanox

BBS2

ALMS1

Beweise vor dieser Studie

Ziliopathien sind eine vielfältige Gruppe von Erkrankungen, die durch primäre Zilienfunktionsstörungen verursacht werden und für die derzeit keine krankheitsspezifischen Behandlungen zur Verfügung stehen. Das Bardet-Biedl-Syndrom (BBS) ist die archetypische Ciliopathie mit multisystemischen Merkmalen, die mit dysfunktionalen Zilien assoziiert sind. BBS teilt viele gemeinsame Phänotypen mit einer anderen Adipositas-bedingten Ciliopathie, dem Alström-Syndrom (AS). Nonsense-Mutationen sind für etwa 11% bzw. 40% der BBS- und AS-Fälle verantwortlich. Diese Mutationen führen zu einem vorzeitigen Beendigungskodon (PTC), das die Translation stoppt. Translationale Readthrough-induzierende Medikamente (TRIDs) wie PTC124 (Ataluren) und Amlexanox können das Durchlesen von PTCs erleichtern, um die Proteinexpression in voller Länge wiederherzustellen. Diese waren in anderen In-vitro-Modellen von Choroiderämie, Usher-Syndrom und RP2-assoziierterRetinitis pigmentosa wirksam, müssen aber noch in einem humanen Ciliopathie-Modell getestet werden.

 Mehrwert dieser Studie

Unsere Studie ist die erste, die die Wirksamkeit der translationalen Readthrough-Therapie in zwei verschiedenen menschlichen Ciliopathie-Modellen berichtet, nämlich in Patientenfibroblasten, die Nonsense-Mutationen in den BBS2- und ALMS1-Genen beherbergen. Nach der Behandlung von Patientenzellen mit PTC124 oder Amlexanox zeigten wir erhöhte mRNA-Transkriptspiegel und eine Erholung der BBS2- und ALMS1-Proteinexpression in voller Länge.

Vor der Behandlung stellten wir eine fehlerhafte Zilienbildung in den Fibroblasten des BBS2-Patienten und eine Ziliarfunktionsstörung in beiden Zelllinien fest. Nach der Behandlung konnten wir die Zilienbildung und die Erholungsfunktion signifikant verbessern.

 Implikationen aller verfügbaren Evidenz

Unsere Studie stellt eine neuartige Therapie zur Behandlung von BBS und AS vor, für die es keine Behandlung gibt. Die Wiederherstellung der BBS2- und ALMS1-Expression in voller Länge und die Korrektur anatomischer und funktioneller Ziliardefekte deutet darauf hin, dass TRIDs eine potenzielle therapeutische Option für die Behandlung von Nonsense-vermittelten Ziliopathien sind. Diese Ergebnisse liefern den Machbarkeitsnachweis für eine mögliche klinische Translation und Anwendung zur Behandlung eines breiten Spektrums von Ziliopathien.

  1. Einleitung

Primäre Zilien sind auf Mikrotubuli basierende Anhängsel, die sich von der Zellmembran erstrecken. Nicht zu verwechseln mit beweglichen Zilien, die Flüssigkeit über Membranoberflächen bewegen, sind primäre Zilien sensorische Organellen und regulieren verschiedene Signalwege wie Sonic Hedgehog (SHH), WNT, transformierende Wachstumsfaktor-β (TGFβ) und andere, die durch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren reguliert werden [[1]]. Ziliar dysfunktion verursacht eine Reihe von Störungen, die kollektiv als Ziliopathien bezeichnet werden [[2]]. Da primäre Zilien auf praktisch allen Wirbeltierzelltypen gefunden werden, kann eine Ziliardysfunktion einen multisystemischen Phänotyp verursachen, einschließlich Retinopathie, Fettleibigkeit, Polydaktylie, kognitiver Beeinträchtigung, Nierenanomalien, Defekten des zentralen Nervensystems und kraniofazialen Anomalien [[2],[3]]. Nicht-syndromale Ziliopathien, bei denen die Ziliarfunktionsstörung auf ein einzelnes Organ oder Gewebetyp beschränkt ist, können ebenfalls auftreten. Obwohl Ziliopathien individuell selten sind, wird geschätzt, dass sie insgesamt etwa 1:1000 Menschen weltweit betreffen [[4],[5]].

Ziliopathien werden überwiegend autosomal-rezessiv vererbt, es gibt jedoch zahlreiche Berichte, die Modifikatorallele implizieren [6, 7, 8]. Die meisten Ciliopathie-Gene kodieren Proteine, die mit dem Transport oder der Funktion von Ziliaren zusammenhängen. Das Ziliaraxonem ist über den vom Mutterzentriolen abgeleiteten Basalkörper in der Zelle verankert [[9]], wird es über eine spezielle Form des mikrotubulibasierten Handels gebaut und gewartet, die als intraflagellarer Transport (IFT) bezeichnet wird [[10]]. Die präzise Koordination des Ziliarhandels und der anschließenden funktionellen Spezifität hängt nicht nur von der IFT, sondern auch von regulatorischen Aspekten am Basalkörper ab.

Das Bardet-Biedl-Syndrom (BBS) gilt als archetypische Ciliopathie, da Patienten die multisystemischen Merkmale aufweisen, die mit einer Ziliarfunktionsstörung verbunden sind [[11]]. BBS ist ein wertvolles Krankheitsmodell für die Entwicklung von Therapeutika, die auf andere Ziliopathien übertragen werden können. Pathogene Varianten in mindestens 23 Genen (BBS1-23), mit Rollen beim Zilienproteintransport und IFT, wurden identifiziert und machen etwa 80% der BBS-Fälle aus [11, 12, 13, 14]. Es gibt keine eindeutigen Genotyp-Phänotyp-Korrelationen, obwohl einige Gene mit einem bestimmten Phänotyp assoziiert sind, wie BBS1 mit milderer Nierenbeteiligung [[15],[16]]. BBS1, BBS2, BBS4, BBS5, BBS7, BBS8, BBS9 und BBS18 bilden das BBSome, einen hochkonservierten Proteinkomplex, der eine entscheidende Rolle bei der Regulierung des Zilienproteintransports und IFT [17, 18, 19, 20, 21, 22]. Varianten in BBS2 (OMIM#606151) sind für 8-18% der BBS-Fälle verantwortlich und verursachen einen schwereren retinalen Phänotyp im Vergleich zu BBS1 [23, 24, 25, 26, 27]. Das BBS2-Gen erstreckt sich über ~53 kb auf Chromosom 16q13, besteht aus 17 Exons und kodiert für ein 721-Aminosäureprotein [[27]]. Von den 90 einzigartigen Mutationen, die in der Human Gene Mutation Database (HGMD, Abgerufen im April 2021) dokumentiert sind, waren ~ 19% pathogene Nonsense-Varianten, die zu einem vorzeitigen Beendigungscodon (PTC) führten. Die am häufigsten erkannten Varianten sind c.72C>G p.(Tyr24*), c.823C>T p. (Arg275*) und c.565C>T, p. (Arg189*) [[26], [28]].

Im Gegensatz zur Locus-Heterogenität, die mit BBS assoziiert ist, ist das Alström-Syndrom (AS) eine monogene Ciliopathie, die ausschließlich mit Varianten in ALMS1 assoziiert ist (OMIM#606844) [[29]]. Ungefähr 40% der pathogenen ALMS1-Varianten sind Unsinnsmutationen, was zu einem Funktionsverlust führt [[29],[30]]. ALMS1 erstreckt sich über ~ 230 kb auf Chromosom 2p13.1 und besteht aus 23 Exons, die für ein 4169-Aminosäureprotein kodieren [[29]]. ALMS1 ist ein Basalprotein, das am proximalen Ende des Zentriolen lokalisiert ist und daher am Transport und erhalt des Ziliarproteins beteiligt ist [[29],31, 32, 33]. ALMS1 spielt eine Rolle bei der Entwicklung der Netzhaut, leitet die Photorezeptorreifung und die korrekte Organisation, aber sein genauer Krankheitsmechanismus bleibt unklar [34, 35, 36, 37, 38].

Derzeit stehen den Patienten keine krankheitsspezifischen Behandlungen für eine Ciliopathie zur Verfügung, und bestehende Interventionen zielen auf eine symptomatische Kontrolle wie das Management von Fettleibigkeit ab .[39],[40]]. Aufgrund der systemischen Natur von BBS und AS liegt der aktuelle Fokus auf der Entwicklung genetischer Therapien zur globalen Korrektur des molekularen Defekts [[39]]. Die Gentherapie müsste systemisch durchgeführt werden, es bestehen jedoch weiterhin Bedenken hinsichtlich der Transfektion von Zellen mit Adeno-assoziierten Viren (AAV) oder Lentiviren im Hinblick auf eine induzierte zytotoxische Immunantwort [[10]]. Darüber hinaus sind AAV-Vektoren durch ihre Frachtgröße (≤5 kb) begrenzt, was die Lieferung großer Gene wie vieler Zilienproteine einschließlich ALMS1 (cDNA 13 kb) erschwert [[41]]. Da Ziliopathien eine enorme genetische Heterogenität aufweisen, ist die Gentherapie aufgrund der Kosten begrenzt. Daher müssen andere, agnostischere Therapieoptionen erforscht werden.

Translationale Readthrough- oder Nonsense-Suppressionstherapie verwendet TRIDs wie Designer-Aminoglykoside (NB30, NB54, NB74, NB84 und NB124) und nicht-aminoglykosidische niedermolekulare Arzneimittel einschließlich PTC124 (3- [5-(2-Fluorphenyl)-1,2,4-Oxadiazol-3-yl] Benzoesäure oder Ataluren), Readthrough-Verbindungen (RTC13 und RTC14), Amlexanox (2-Amino-7-Isopropyl-5-oxo-5H-chromeno[2,3-b]pyridin-3-carbonsäure) und DAP (2,6 – Diaminopurin) [42, 43, 44, 45, 46, 47, 48]. Traditionelle Aminoglykoside wie Geneticin und G418 sind am wirksamsten, haben jedoch eine hohe Zytotoxizität [[49]]. Der genaue Wirkmechanismus für die meisten TRIDs ist unbekannt, es ist jedoch bekannt, dass Aminoglykoside an die ribosomale A-Stelle binden, ihre Erkennung von PTCs stören und die Insertion einer nahezu verwandten tRNA anstelle der eukaryotischen Freisetzungsfaktoren ermöglichen [[50]]. Dies erleichtert das Durchlesen des PTC und die Translation eines funktionellen Proteins in voller Länge, das in einigen Studien bis zu 60% der Wildtyp-Spiegel erreicht [[50],[51]].

PtC124 (Ataluren) Behandlung von ausgewählten nicht-syndromischen und syndromalen netztinalen Dystrophien wurde zuvor beschrieben, die signifikante Funktion bei Choroiderämie (CHM) Patienten dermalen Fibroblasten, human induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) abgeleiteten retinalen Pigmentepithel (RPE) und dem chmru848 transgenen Zebrafisch, in RP2-bedingterRetinitis pigmentosa (RP) hiPSC-RPE und in Zellkulturmodellen und organotypischen Netzhautkulturen aus USH2A und USH1C- assoziierte Usher-Syndrom-Patienten [[43],[45],[52],[53]]. Im Jahr 2014 wurde PTC124 von der Europäischen Arzneimittel-Agentur zur Behandlung der Duchenne-Muskeldystrophie zugelassen. Amlexanox wurde traditionell zur Behandlung von Asthma und Mundgeschwüren eingesetzt, aber durch ein Luciferase-basiertes Screening-System wurde es als ein leistungsfähiges Dual-Purpose-Medikament identifiziert, das den unsinnsvermittelten mRNA-Zerfall hemmen und translationale Readthrough-Eigenschaften aufrechterhalten könnte [[54]]. Die Durchleseeffizienz kann verbessert werden, indem die Anzahl der stabilen mRNA-Transkripte erhöht wird, die durch NMD-Hemmung verfügbar sind [[54]].

Dies ist die erste Studie, die eine erfolgreiche Behandlung von BBS- und AS-Ciliopathien mit Nonsense-Suppressionstherapie zeigt. Wir behandelten BBS2Y24*/R275* und ALMS1S1645*/S1645* Patientenfibroblasten mi t PTC124 und Amlexanox, da beide Verbindungen zuvor bei Patienten angewendet wurden. Eine erhöhte Wiederherstellung der Transkript- und Proteinexpression ging mit einer Verbesserung der Ziliogenese und der Ziliarfunktionsstörungen einher, was den möglichen Nutzen von TRIDs zur Behandlung einer Reihe von Nonsense-Mutations-abhängigen Ziliopathien hervorhob.

  1. 2. Methoden

2.1 Ethik

Das Studienprotokoll entsprach den Grundsätzen der Deklaration von Helsinki und erhielt die ethische Genehmigung des National Research Ethics Service West Midlands Committee - Staffordshire, REC Referenz 11/WM/0127 für Hautbiopsien im Rahmen der EURO-Wabb (European Wolfram, Alstrom and Bardet-Biedl Syndrome) Studie. Von allen Teilnehmern wurde vor ihrer Aufnahme in diese Studie eine schriftliche, informierte Einwilligung eingeholt.

2.2 Studienteilnehmer und klinische Merkmale

Hautbiopsien wurden von einer gesunden Kontrolle (WT), einem BBS2-Patienten mit molekular bestätigtem c.72C>G, p. (Tyr24*) in Exon 1 (UAG Stop Codon) und c.823C>T, p. (Arg275*) in Exon 8 (UAA-Stop-Codon) und einem ALMS1-Patienten mit molekular bestätigtem c.4937C>A, p. (Ser1645*) und c.4937C>A, p. (Ser1645*) in Exon 8 (beide UAA Stop Codons).

Der BBS2Y24*/R275*-Patient war ein 17-jähriger Mann, der typische BBS-Kriterien wie Stäbchen-Zapfen-Dystrophie, Fettleibigkeit, Nierendysplasie, Polydaktylie und eine typische Gesichtsform aufwies. Weitere charakteristische Merkmale waren Sprachverzögerung, Strabismus und ein hoher gewölbter Gaumen. Der Patient wurde im Alter von 2 Jahren diagnostiziert und jährlich von einem spezialisierten BBS-Team nachverfolgt. Im Alter von 16 Jahren wurde er als schwer sehbehindert registriert. Dieser Patient wird in dieser Studie als BBS2-P1 bezeichnet. Alle Mutationen beziehen sich auf das kanonische BBS2-Transkript ENST00000245157.5.

Die ALMS1S1645*/S1645* Patient, aus einer früheren Studie als P14 bezeichnet [[55]], war ein 18-jähriger Mann, der im Alter von 3 Monaten Nystagmus und Photophobie zeigte und im Alter von 13 Jahren stark sehbehindert war. Der Patient hat auch einen bilateralen sensorineuralen Hörverlust, unterstützt durch Hörgeräte, Fettleibigkeit, Diabetes mellitus und Fettlebererkrankungen mit erhöhtem Plasmatriglycerid und niedrigem HDL-Cholesterin, die auf eine metabolische Dyslipidämie hinweisen. Zum Zeitpunkt der Biopsie wurden keine Herz- oder Nierenanomalien beobachtet. Alle Mutationen beziehen sich auf das kanonische TRANSKRIPT VON ALMS1 ENST00000613296.4.

Die Wildtyp-Kontrollfibroblasten, die in keiner anderen Studie aufgetreten sind, wurden von einem 28-jährigen gesunden kaukasischen Mann ohne bekannte Krankengeschichte oder Mutationen in bekannten Ciliopathie-Genen abgeleitet.

2.3 Fibroblasten-Zellkultur und Dosierung

Vier-Millimeter-Punch-Hautbiopsien wurden unter örtlicher Betäubung von einer gesunden Kontrolle, BBS2Y24*/R275*und ALMS1S1645*/S1645* Patienten entnommen und wie zuvor beschrieben verarbeitet [[49]]. Fibroblasten wurden in Fibroblasten-Wachstumsmedien (DMEM (ThermoFisher Scientific, Katze # 41966029), 15% FBS (ThermoFisher Scientific, Katze # 10500064), 1% P / S (ThermoFisher Scientific, Katze # 15140122) gehalten, die alle 4-5 Tage ersetzt wurden und Zellen mit 80-90% Konfluenz durchliefen. Vor der Beschichtung wurden Fibroblasten 24 h lang serumverhungert, um die Ziliarierung (DMEM, 1% P / S) zu fördern. Fibroblasten wurden mit 300.000 Zellen pro Vertiefung in einer 12-Well-Platte oder 600.000 pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte plattiert und für weitere 24 Stunden serumverhungert. Anschließend wurden die Zellen mit 40 μM PTC124 (SelleckChem, TX, USA, cat#S6003) oder 250 μM Amlexanox (Abcam, UK, ab142825, cat#ab142825) dosiert, wie zuvor beschrieben [[49],[56]].

2.4 Western Blotting

Die Proben wurden wie zuvor beschrieben durch Western Blotting analysiert [[49]]. Kurz gesagt, die Zellen wurden mit eiskaltem PBS gewaschen und der Gesamtproteinextrakt wurde mit RIPA-Puffer (ThermoFisher Scientific, MA, USA, cat #89900) in einem Verhältnis von 5 × 10 hergestellt.6 Cells/ml-Puffer und 1x Halt ™ Protease- und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail (ThermoFisher Scientific, MA, USA, cat#78440). Proteine wurden auf 4–15% Mini-PROTEAN® TGX ™ Gelen (Bio-RadInc., CA, USA, cat#4561025) aufgelöst und unter Verwendung einer halbtrockenen Trans-Blot® SD-Transferzelle (Bio-Rad Inc., CA, USA) auf eine Immun-Blot™ PVDF-Membran übertragen. Membranen wurden mit 5% fettfreier Trockenmilch in 0,1% PBS/T für 1 h blockiert. Eine vollständige Liste der verwendeten primären und sekundären Antikörper finden Sie in den ergänzenden Informationen. Die Blots wurden mit dem ChemiDoc XRS ™ Imaging System (Bio-Rad Inc., CA, USA) gescannt und mit der Software Fiji/ImageJ quantitativ analysiert (National Institutes of Health, MD, USA, RRID: SCR_002285).

2.5 Immunzytochemie

Die Zellen wurden 24 Stunden nach der Dosierung gesammelt und vor der Fixierung in eiskaltem Methanol in PBS gewaschen, in PBS-0,3% Triton X-100 permeabilisiert und folglich mit 10% normalem Ziegenserum blockiert (ThermoFisher Scientific, MA, USA, Katze #31872). Die Zellen wurden über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern inkubiert, die in der ergänzenden Tabelle 1 gefunden wurden. Alexa-Fluor® 488- oder 647-konjugierte sekundäre Antikörper wurden für den primären Antikörpernachweis verwendet. Dias wurden mit ProLong montiertTM Diamond Antifade Mountant mit DAPI (ThermoFisher Scientific, MA, USA, Kat#P36962). Die Bildgebung erfolgte mit dem Fluoreszenzmikroskop Zeiss LSM 710 (Zeiss Research, Deutschland) und die Bilder wurden mit Fiji/Image J.

2,6 RT-qPCR

RT-qPCR wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt [[57]]. Kurz gesagt, die RNA-Extraktion wurde mit dem RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Deutschland, Cat#Z4014) durchgeführt und cDNA wurde aus 500 ng mit dem SuperScript III First Strang cDNA Synthesekit (Invitrogen, CA, USA, cat#18080051) gemäß den Anweisungen des Herstellers synthetisiert. Die Transkriptwerte wurden mit SYBR Green MasterMix (ThermoFisher Scientific, MA, USA, cat#4309155) auf einem StepOne Real-Time PCR-System (Applied Biosystems, ThermoFisher, Paisley, UK) analysiert. Alle Transkriptstufen wurden dreifach gemessen. Die für die RT-qPCR verwendeten Primer sind in der ergänzenden Tabelle 2 aufgeführt. GAPDH, ACTB und G6PD wurden als Referenzgene verwendet und die Transkriptspiegel wurden auf WT-undosierte Fibroblasten normalisiert.

2.7 Statistische Auswertung

Die statistische Analyse wurde mit Excel (Microsoft, WA, USA) durchgeführt. Gegebenenfalls wurde die Normalität der Daten zunächst durch die Q-Q-Plotanalyse und den Shapiro-Wilk-Test bestätigt. Ein zweiseitiger ungepaarter Student's t-Test wurde für Vergleichsstudien verwendet. Ein p-Wertvon <0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Die Signifikanzwerte wurden festgelegt, wenn P 0,05 (*), P < 0,01 (**), P < 0,001 (***) <. Alle Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt, sofern nicht anders angegeben. Alle Experimente wurden mit n = 3 biologischen Replikaten durchgeführt.

2.8 Rolle der Finanzierungsquelle

Der Geldgeber der Studie hatte keine Rolle beim Studiendesign, der Datenerhebung, der Datenanalyse, der Dateninterpretation oder dem Schreiben des Berichts. Die korrespondierenden Autoren hatten vollen Zugriff auf alle Daten der Studie und übernehmen die Verantwortung für die Einreichung zur Veröffentlichung.

  1. Ergebnisse

3.1 Behandlung von BBS2Y24*/R275*-Fibroblasten mit TRIDs wiederhergestellte BBS2-Expression in voller Länge

Wir bewerteten die Wirksamkeit von PTC124- und Amlexanox-Behandlung, um (i) den nonsense-vermittelten Zerfall (NMD) zu hemmen und (ii) Nonsense-Mutationen durchzulesen und das funktionelle BBS2 in voller Länge in einer BBS2Y24*/R275*-Patienten-Dermal-Fibroblasten-Linie wiederherzustellen. RT-qPCR wurde durchgeführt, um die Spiegel des BBS2-mRNA-Transkripts in Wildtyp (WT), unbehandelt BBS2Y24 * / R275 * und BBS2 zu untersuchen Y24*/R275* Fibroblasten, die in drei unabhängigen Experimenten entweder mit 40 μM PTC124 oder 250 μM Amlexanox behandelt wurden. Unbehandelte BBS2Y24*/R275*-Patientenzellenzeigten signifikant reduzierte BBS2-Transkripte, die 20% der WT-Werte erreichten(P < 0,0001, Student's t-Test). Die Behandlung mit PTC124 oder Amlexanox erhöhte jedoch signifikant die BBS2-Transkripte auf 43,23 ± 23,9% bzw. 52,4 ± 14,37% (P < 0,013, Student's t-Test)der WT-Spiegel, unterschied sich jedoch nicht signifikant zwischen den Medikamenten (P < 0,497, Student's t-Test)

Western Blot wurde durchgeführt, um die BBS2-Proteinexpression in unbehandelten und behandelten WT-Fibroblasten (mit entweder 40 μM PTC124 oder 250 μM Amlexanox) als Kontrollen nachzuweisen, jedoch wurde kein signifikanter Unterschied beobachtet (P < 0,64 bzw. P < 0,17, Student's t-Test)(Abb. 1b). Die BBS2-Expression war in unbehandelten BBS2Y24*/R275*-Fibroblasten kaum nachweisbar(Abb. 1c). Nach der Behandlung von Patientenfibroblasten wurde die BBS2-Expression jedoch auf 40,40 ± 2,03% bzw. 39,41 ± 3,46% der WT-Spiegel mit 40 μM PTC124 bzw. 250 μM Amlexanox wiederhergestellt(Abb. 1c-d). Diese Daten deuten darauf hin, dass sowohl PTC124 als auch Amlexanox NMD in ähnlichem Maße hemmen und das translationale Durchlesen in BBS2Y24 */R275* Fibroblasten beeinflussen können, wodurch gleiche Mengen an BBS2-Protein in voller Länge wiederhergestellt werden. Um die wiederhergestellte BBS2-Proteinfunktionalität zu bewerten, untersuchten wir die Auswirkungen der TRID-Behandlung auf die Korrektur anatomischer und funktioneller Ziliendefekte.

3.2 Behandlung von BBS2Y24*/R275*-Fibroblasten mit TRIDs verbesserte signifikant die Ziliogenese

Da das BBSome für die primäre Zilienbildung und Signalfunktion benötigt wird, wurden die nachgeschalteten Effekte der Rettung der BBS2-Proteinexpression in Patientenfibroblasten durch Wiederherstellung der Zilienbildung (Zilienlänge und Anteil an bewimperten Zellen (Ciliation)) nach Behandlung mit PTC124 oder Amlexanox untersucht (Abb. 2a-d). Der Ziliarmembranmarker ARL13B und acetyliertes Tubulin wurden verwendet, um das Mikrotubuli-Axonem unter allenBedingungen zu markieren ( n = 3, wobei mindestens 100 Zellen pro Replikat pro Bedingung analysiert wurden) (Abb. 2a-d). Die Quantifizierung der Ziliarlänge ergab, dass die durchschnittliche Zilienlänge signifikant um 22% von 5,93 ± 0,18 μm in WT-Fibroblasten auf 4,64 ± 0,17 μm in unbehandelten BBS2Y24*/R275*-Fibroblasten reduziert war (P < 0,0001, Student's t-Test)(Abb. 2e, 2f und 2i). Die Behandlung mit PTC124 erhöhte die durchschnittliche Zilienlänge signifikant um 10% auf 5,11 ± 0,16 μm (P < 0,049, Student's t-Test),obwohl diese immer noch deutlich kürzer war als die WT-Werte (P < 0,001, Student's t-Test)(Abb. 2e-i). Die Behandlung mit Amlexanox war wirksamer, da sie die Zilienlänge in mit Amlexanox behandelten Zellen signifikant um 17% auf 5,45 ± 0,25 μm (P < 0,009, Student's t-Test)erhöhte, was sich nicht signifikant von den WT-Werten unterschied (P < 0,146, Student's t-Test) (Abb. 2e-i). Auch bei mutierten BBS2Y24*/R275*-Fibroblasten mit 70,87 ± 1,21% (n = 73/103) Zellen war die Ciliation signifikant reduziert, verglichen mit 90,29 ± 3,23% (n = 93/103) in WT-Fibroblasten (P < 0,0001, Student's t-Test)(Abb. 2j). Die Behandlung mit PTC124 oder Amlexanox erhöhte sowohl den Anteil der Flimmerzellen signifikant auf 85,57 ± 1,62% (n = 89/104) (P < 0,00029, Student's t-Test)als auch auf 82,41 ± 1,47% (n = 89/108) (P < 0,0087, Student's t-Test)(Abb. 2j). Dies deutet darauf hin, dass die Behandlung mit PTC124 und Amlexanox eine fehlerhafte Flimmerung nach der Wiederherstellung des BBS2-Proteins in voller Länge retten kann.

3.3 Die Behandlung mit TRIDs stellte die Zilienfunktion in BBS2Y24*/R275*-Fibroblasten signifikant wieder her

BBS2 ist eine kritische Komponente des BBSome, das die IFT-A- und IFT-B-Untereinheiten kooperativ bindet, um den IFT-Komplex zu bilden, der den Transport von Ziliarproteinen erleichtert. IFT88 ist ein kritischer Bestandteil der IFT-B-Untereinheit und der Ziliartransportmaschinerie, seine Ziliarlokalisation ist ein Hinweis auf funktionale IFT entlang des Ziliums. Die IFT88-Expression wurde in 78,72 ± 2,57% der WT-Zellen (n = 74/94) entlang des Ziliaraxonems mit Akkumulation an der Ziliarspitze nachgewiesen (Abb. 3a und 3e). Die IFT88-Expression war bei BBS2Y24*/R275*-Patientenzilien signifikant reduziert, wobei nur 22,54 ± 4,52% der Zellen (n = 23/102) eine Ziliarlokalisation aufwiesen (P < 0,00094, Student's t-Test) (Abb. 3b und 3e). Nach der Behandlung mit PTC124 und Amlexanox wurde die IFT88-Expression in 45,54 ± 3,80% (n = 46/101) (P < 0,0048, Student's t-Test)bzw. 54,08 ± 5,19% (n = 53/98) (P < 0,0085, Student's t-Test)von BBS2Y24*/R275* Patientenzilien wiederhergestellt.

Der G-Protein-gekoppelte Rezeptor SSTR3 wurde als Indikator für den korrekten Ziliartransport von Proteinfracht verwendet. Obwohl es entlang des Ziliaraxonems in WT-Fibroblasten nicht nachgewiesen wurde, möglicherweise als Folge eines zellspezifischen Eintritts in das Cilium, wurde eine klare Lokalisation von SSTR3 an der Basis des Ciliums nachgewiesen, das direkt mit dem Ziliaraxonem in 95,37 ± 1,49% Zellen (n = 103/108) verbunden ist (Abb. 4a). In BBS2Y24*/R275*-Fibroblasten war SSTR3 signifikant vom Cilium weg fehllokalisiert und nur in 77,89 ± 3,78% der Zellen (n = 81/104) direkt an das Axonem gebunden (P < 0,002, Student's t-Test) (Abb. 4b). Die Behandlung von Zellen mit PTC124 und Amlexanox stellte die SSTR3-Lokalisation neben dem Axonem wieder her und erhöhte signifikant die SSTR3-Lokalisation in 91,09 ± 1,62% (n = 92/101) (P < 0,0014) bzw. 90,48 ± 2,43% (n = 95/105) (P < 0,0057, Student's t-Test)der Zellen (Abb. 4c-e). Diese Daten deuten auf eine signifikante Rettung der Ziliarfunktion zusammen mit der Ziliogenese in Patientenzellen nach der TRID-Behandlung hin.

3.4 Behandlung von ALMS1S1645*/S1645* Fibroblasten mit TRIDs wiederherstellte die ALMS1-Expression in voller Länge im Basal des Ciliums

Primäre dermale Fibroblasten eines Patienten mit Alström-Syndrom (ALMS1S1645*/S1645*)wurden als zweites Ciliopathiemodell verwendet, um die Wirksamkeit von PTC124 und Amlexanox zu bewerten. RT-qPCR von ALMS1S1645*/S1645* Fibroblasten ergab, dass ALMS1 mRNA-Transkripte signifikant auf 24,65 ± 6,91% der WT-Spiegel reduziert waren. Nach der Behandlung mit Amlexanox stieg dieser signifikant auf 64,82 ± 19,03% der Wildtyp-Spiegel (P < 0,013, Student's t-Test), ähnlich dem Effekt, der in BBS2Y24*/R275*-Zellen beobachtet wurde (Abb. 5a). Die Behandlung mit PTC124 veränderte die ALMS1-Transkriptspiegel im Vergleich zu unbehandelten ALMS1S1645*/S1645*-Fibroblasten nicht signifikant und erreichte nur 25,71 ± 3,28% der Wildtyp-Spiegel (P < 0•41, Student's t-Test) (Abb. 5a). Die Immunfärbung von WT-Fibroblasten mit einem Antikörper gegen ALMS1 fand in 97,32 ± 1,34% (n = 109/112) gesunder Zellen eine Proteinexpression, die an der Basis der Zilien neben dem Ziliaraxonm lokalisiert war. Dies war signifikant reduziert in ALMS1S1645*/S1645* Fibroblasten, wo ALMS1 nur in 7,67 ± 1,76% (n = 9/114) der Zilien vorhanden war (P < 0,0001, Student's t-Test)(Abb. 5b-d). Die Behandlung von ALMS1S1645*/S1645* Fibroblasten mit TRIDs stellte die ALMS1-Proteinlokalisation in 37,50 ± 6,23% der mit PTC124 behandelten (n = 38/101) (P < 0,0031, Student's t-Test)und 35,29 ± 3,86% ( n = 36/102) (P < 0,00046, Student's t-Test) von amlexanox-behandelten Zellen (Abb. 5b und 5e-f) signifikant wieder her.

3.5 Die Ziliogenese war bei ALMS1S1645*/S1645*-Fibroblasten nicht beeinträchtigt

Die Ziliogenese, gemessen mit ARL13B und acetylierter Tubulinkolokalisation, war bei ALMS1S1645*/S1645*-Fibroblasten nicht beeinträchtigt, wobei keine signifikanten anatomischen Defekte hinsichtlich Zilienlänge und Ziliaration beobachtet wurden ( n = 3, wobei mindestens 100 Zellen pro Replikat pro Zustand analysiertwurden) (Abb. 6a-f). Zilienlänge gemessen 5,86 ± 0,27 μm in ALMS1S1645*/S1645* Fibroblasten im Vergleich zu 5,93 ± 0,18 μm in WT (P < 0,84, Student's t-Test)(Abb. 6e). Bei Patientenfibroblasten, die mit PTC124 oder Amlexanox mit mittleren Längen von 5,75 ± 0,19 μm (P < 0,52, Student's t-Test)bzw. 5,69 ± 0,21 μm behandelt wurden, wurde keine Veränderung der Zilienlänge beobachtet (P < 0,67, Student's t-Test).

Ähnliche Ziliarwerte wurden zwischen WT- und ALMS1S1645*/S1645*-Fibroblasten bei 90,29 ± 3,23% (n = 93/103) bzw. 88,23 ±2,06% ( n = 90/102) (P < 0,61, Student's t-Test) beobachtet (Abb. 6f). Zusätzlich wird ALMS1S1645*/S1645* Die Fibroblasten unterschieden sich nach der Behandlung mit PTC124 und Amlexanox mit Kimmerwerten von 85,14 ± 3,36% (n = 86/101) (P < 0,44, Student's t-Test)bzw. 87,88 ± 2,57% (n = 87/99) (P < 0,95, Student's t-Test)(Abb. 6f) nicht signifikant.

3.6 Wiederherstellung der Zilienfunktion in ALMS1S1645*/S1645* Fibroblasten

Ähnlich wie bei BBS2Y24*/R275* Fibroblasten war die IFT88-Expression in unbehandelten ALS1S1645*/S1645*/S1645*-Fibroblasten auf 18,95 ± 6,89% (n = 18/95) reduziert, was auf einen signifikanten Defekt der Ziliartransportmaschinen (P < 0,0001, Student's t-Test)hindeutet (Abb. 7a-b). Die IFT88-Expression wurde bei der Behandlung mit PTC124 und Amlexanox signifikant auf 58,16 ± 4,09% (n = 57/98) (P < 0,011, Student's t-Test) bzw. 59 ± 5,03% (59/100) (P < 0,0078, Student's t-Test)(Abb. 7c-e) wiederhergestellt. SSTR3-Fehllokalisation, die auf einen defekten Ziliarproteintransport hindeutet, wurde auch in ALMS1S1645*/S1645*-Fibroblasten beobachtet, wo SSTR3 direkt neben dem Ziliaraxonem in nur 76,92 ± 3,42% der Zellen exprimiert wurde (78/102) (P < 0,011, Student's t-Test) (Abb. 8a-b). Nach der Behandlung mit PTC124 oder Amlexanox wurde die korrekte SSTR3-Lokalisation jedoch signifikant auf 88,89 ± 1,99% (n = 88/99) (P < 0,0095, Student's t-Test) bzw. 87,76 ± 2,14% (n = 86/98) (P < 0,0031, Student's t-Test) verbessert (Abb. 8c-e). Diese Daten deuten auf eine Wiederherstellung der Ziliarfunktion in ALMS1S1645*/S1645*-Fibroblasten nach Behandlung mit TRIDs hin.

  1. Diskussion

Dies ist die erste Studie, die die Korrektur von anatomischen und funktionellen Ziliardefekten in zwei humanen Ciliopathie-Modellen beschreibt und ein ermutigender Schritt in Richtung der Entwicklung zukünftiger Therapeutika ist. Wir untersuchten die Wirksamkeit von zwei translationalen Readthrough-induzierenden Medikamenten (TRIDs), PTC124 und Amlexanox, als mögliche Behandlung zur Wiederherstellung des BBS2- und ALMS1-Proteins in voller Länge in BBS2Y24 * / R275 * bzw. ALMS1S1645 * / S1645 * Patientenfibroblasten. Wir beobachteten eine signifikante Wiederherstellung zwischen 35-40% BBS2- und ALMS1-Protein in voller Länge im Vergleich zu Wildtyp-Spiegeln nach der Behandlung mit einer der beiden Wirkstoffverbindungen.

Das BBS2-Zellmodellsystem führte zu einer defekten Ziliogenese, aber es ist immer noch nicht klar, inwieweit die humane zellspezifische Ziliendysfunktion zum systemischen BBS-Phänotyp beiträgt [[58],[59]]. Die gestörte Ziliogenese (Zilienlänge und Ziliarbildung) in menschlichen Fibroblasten kann ein zellspezifischer Effekt sein, wie er in Mausstudien beobachtet wurde [[55],[58],[59]]. Im Gegensatz dazu wurden bei ALMS1-Fibroblasten keine anatomischen Ziliardefekte beobachtet, analog zu früheren Berichten [[37],[55],[60]]. Durch den Einsatz von IFT88- und SSTR3-Lokalisationsstudien wurden jedoch in beiden Krankheitsmodellen Defekte im Ziliartransport erfasst, die nach der Behandlung korrigiert wurden. Der Verlust der IFT88-Expression in dermalen Fibroblasten wurde zuvor als Messwert für eine beeinträchtigte IFT bei Patienten mit Jeune- und Mainzer-Saldino-Ciliopathie berichtet [[61],[62]]. Hier ist die Wiederherstellung von IFT88 zu ähnlichen Expressionsmustern entlang des Ziliaraxonems, das in gesunden Kontrollfibroblasten beschrieben ist, ein Hinweis auf eine Rückkehr des Proteintransports innerhalb des Ciliums und eine zuverlässige Anzeige der Zilienfunktion nach der Wiederherstellung der BBS2- und ALMS1-Proteinexpression [[62]].

SSTR3 ist ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor (GPCR) und sein korrekter Transport ist wichtig für die Weiterleitung von Hinweisen aus der extrazellulären Umgebung [[63]]. Sstr3-Fehllokalisation wurde zuvor im Bbs2−/−-Mausmodell berichtet, da es trotz hoher Expressionsniveaus völlig nicht in das Ziliaraxonem lokalisiert werden konnte [[64]]. Es ist bekannt, dass seine Lokalisierung vom BBSome-Komplex abhängt [[65]].

In WT dermalen Fibroblasten haben wir SSTR3 am Basalkörper nachgewiesen, das direkt mit dem Ziliaraxonem verbunden ist, obwohl es nicht in das Cilium gelangt. Wenn das Cilium nicht betreten wird, kann dies zelltypspezifische Eintrittsmechanismen widerspiegeln. Dennoch beobachteten wir in beiden Patientenzelllinien eine subtile Fehllokalisierung dieses Signals, das leicht neben dem Ziliaraxonem liegt und nach der Behandlung wiederhergestellt werden konnte. Es ist bekannt, dass diese Fehllokalisierung die Proteinsignalkaskaden in den Zilien des Patienten stört [[19]]. Dies ist besonders relevant für die Behandlung von Stäbchen-Zapfen-Dystrophien, die bei BBS und AS weit verbreitet sind, da andere visuelle GPCRs wie Rhodopsin über das BBSome über das Verbindungscilium zum äußeren Segment der Photorezeptorzellen transportiert werden [[66]]. Die Korrektur der SSTR3-Fehllokalisation nach Wiederherstellung der BBS2- und ALMS1-Expression weist auf einen reparierten Frachttransport zum Zilium hin und ist eine zusätzliche Anzeige für die Zilienfunktion.

Wir haben die Immunfluoreszenzanalyse von Zilientransportmaschinen und Fracht als Auslese der Funktionalität verwendet, aber alternative Auslesungen für die Wirkung von TRIDs sind möglich. Veränderungen der intrazellulären Ca2+wurden cAMP- und Insulinspiegel in In-vitro-BBS-Modellen mit Ziliarfunktionsstörungen in Verbindung gebracht, während erhöhter oxidativer Stress und Verlust der entzündlichen Zytokinwirkung zuvor mit einer gestörten Ziliarierung in Verbindung gebracht wurden [67, 68, 69, 70]. Zunächst müssen diese Defekte in Ciliopathiemodellen charakterisiert werden, können aber als alternative Ergebnismaße für zukünftige Studien zur Behandlung von Ziliopathien mit TRIDs dienen.

Der gemeinsame klinische Phänotyp von BBS- und AS-Ciliopathien deutet auf verwandte Rollen für ALMS1- und BBSome-Proteine in der Zilienfunktion und im Proteintransport hin [[71]]. ALMS1 ist im Basalkörper lokalisiert, wo Filamente, die aus dem Basalkomplex herausragen, den Zentrosomen-Linker bilden, der die Paarung der Mutter-Tochter-Zentriolen aufrechterhält [[37]]. Es wurde bereits gezeigt, dass ALMS1 eine Rolle bei der Rekrutierung von CEP250/C-Nap1 spielt, einem Protein, das den Zentrosomen-Linker und eine ähnliche Struktur, die als Ziliarwurzel bekannt ist, verankert [[72]]. Es ist möglich, dass ALMS1 an der Bindung von Proteinen an den Basalkomplex, einschließlich SSTR3, beteiligt ist. Der Verlust von ALMS1 kann zu einer falschen Bindung von SSTR3 und einer daraus resultierenden Fehllokalisierung zum Tochterzentriole führen, da der Zentrosomen-Linker, der zuvor die beiden verbunden hat, verloren geht, was zu Proteintransportdefekten wie den hier festgestellten führt. Aufgrund der funktionellen und nicht strukturellen Zilienanomalien, die durch den Verlust von ALMS1 verursacht werden, sollten sich weitere Untersuchungen von ALMS1S1645 * / S1645 * Fibroblasten auf Ziliarfunktionsstörungen konzentrieren. Rasterelektronenmikroskopie ergab minimale strukturelle Veränderungen in Alms1−/− murinen Cochlea-Zilien [[73]]. Die ultrastrukturelle Analyse von ALMS1S1645*/S1645*-Fibroblasten kann strukturelle Anomalien aufdecken, die aus der Immunfluoreszenzanalyse nicht ersichtlich waren, obwohl dies bei primären als bei beweglichen Zilien wesentlich schwieriger ist [[74]]. In dieser Studie hat die Immunfluoreszenz eine Fehllokalisierung von SSTR3 und den Verlust des intraflagellaren Transports gezeigt. Alternative Techniken wie die Verwendung semipermeabler Zellen, die eine verbesserte Charakterisierung der Diffusionsbarriere zwischen Zytosol und Cilium ermöglichen, wie die präzise Visualisierung des Ziliarproteintransports in und aus dem Axonem, können eine bisher unbekannte Ziliarfunktion aufdecken, die BBS und AS zugrunde liegt [[75],[76]]. Darüber hinaus können elektronenmikroskopische Techniken trotz der immensen technischen Herausforderungen bei der Erfassung primärer Zilien unser Verständnis von strukturellen und funktionellen Ziliaranomalien verbessern, die zur BBS- und AS-Pathophysiologie beitragen, wie z.B. einen gestörten Vesikeltransport vom Golgi-Apparat zum Cilium [[74],[76]].

Weitere Studien der genauen Funktionen jedes BBS-Proteins können unser Verständnis der Krankheitsaätologie und der pleiotropen Natur von BBS verbessern, da zunehmende Beweise darauf hindeuten, dass BBS-Proteine nicht funktionell auf das primäre Cilium beschränkt sind [[77],[78]]. Nicht-ziliarische Rollen für BBS-Proteine wurden zuvor beschrieben, wie die Regulation des Aktin-Zytoskeletts an aktinreichen Stellen in nierenmarkalen Zellen und in der murinen Cochlea und die Lokalisierung im Zentrosom und anderen Zellteilungsuntereinheiten wie Dynactin zur Erleichterung der Mitose [[77],[79]]. Darüber hinaus wurde auch eine Untergruppe von BBS-Proteinen gefunden, die in den Zellkern gelangen. Zum Beispiel wird BBS6 zwischen Zellkern und Zytoplasma transportiert und moduliert die subzelluläre Lage anderer Proteine [[80]]. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass BBS7 dynamische Lokalisierungsmuster zwischen Kern, Zentrosom und Cilium aufweist und gleichzeitig die Transkription direkt durch die Expressionsniveaus von RNF2, einer E3-Ubiquitin-Ligase, die an der Histoncode- und Genregulation beteiligt ist, und ihren Zielgenen reguliert [[81]]. Die Sezierung der nicht-ziliaren und ziliaren Rollen dieser Proteine in nicht bewimpften Zellen wie Lymphozyten könnte unser Wissen über die globale Funktionalität von BBS-Proteinen erweitern und die Entwicklung neuartiger Therapien verbessern. ALMS1 hat auch angebliche nicht-ziliarische Rollen wie die Regulierung der Zellzyklusmaschinerie und des Proteasoms sowie in der zellulären DNA-Schadensantwort [[37]]. Zukünftige Studien, die den Verlust von ALMS1 in diesen Funktionen bewerten, werden einen Einblick in mögliche Beiträge von nicht-ziliaren Rollen von ALMS1 zur AS-Pathophysiologie geben.

Die gemeinsame funktionelle Rettung in beiden Fibroblasten BBS2Y24*/R275* und ALMS1S1645*/S1645* ist ermutigend für den weit verbreiteten Einsatz von TRIDs zur Behandlung einer Reihe von Ziliopathien, die durch verschiedene Nonsense-Mutationen in einem krankheits- und genunabhängigen Ansatz verursacht werden [[46]]. Unsere Daten bestätigten den dualen Wirkmechanismus von Amlexanox in Bezug auf NMD-Hemmung und Nonsense-Unterdrückung sowohl im BBS- als auch im AS-Modell. PtC124 wurde traditionell nicht als NMD-Hemmungsaktivität angesehen, obwohl ein Anstieg der mRNA-Transkriptspiegel in den Fibroblasten des BBS2-Patienten festgestellt wurde, jedoch nicht im AS-Zellmodell nach der Behandlung. In einer früheren Studie, in der PTC124 in Choroiderämiemodellen getestet wurde, wurden erhöhte chm-mRNA-Transkripte im in vivo chmru848 Zebrafisch nachgewiesen, jedoch nicht in den Fibroblasten des CHMY42X/y-Patienten [ [49]].

Der Ausgangswert der mRNA ist wahrscheinlich ein prognostischer Indikator, mit einem minimalen Niveau, das genügend Substrat für das Durchlesen garantiert. Linde et.al berichtet, dass in einer Kohorte von Mukoviszidose-Patienten mit einer identischen CFTR-Mutation p.(W1282*) Patienten mit höheren mRNA-Ausgangswerten nach Gentamicin-Behandlung höhere Durchleseraten zeigten [[82]]. Eine frühere Studie berichtete über keine signifikante Rettung nach der Behandlung von CHMK258* Fibroblasten und entsprechender iPSC-abgeleiteter RPE mit PTC124, die niedrige CHM-Transkriptspiegel zu Studienbeginn (~ 20%) aufwiesen [[43]]. Sarkar et al. zeigten hochvariable CHM-mRNA-Spiegel zwischen Patienten mit der gleichen Nonsense-Mutation [c.715C>T; p.(R239*)] im Bereich von 13–52,6%, aber Konservierung in Transkriptspiegeln zwischen verschiedenen Gewebetypen desselben Patienten (Blut, dermale Fibroblasten und iPSC-abgeleitete RPE) [[57]]. Die Kontrolle /Auslöser von NMD sind nicht vollständig verstanden, und es wurden auch variable mRNA-Spiegel in verschiedenen Geweben desselben Patienten dokumentiert [[83]]. Es ist wahrscheinlich, dass eine erhöhte Transkripthäufigkeit die Durchleseeffizienz verbessert und für die zukünftige Behandlungsstratifizierung verwendet werden könnte.

Es wurde vorgeschlagen, dass bestimmte TRIDs eine Durchlesepräferenz haben, abhängig vom Kontext von PTC (am häufigsten UGA>UAG>UAA) und der umgebenden 5' (am häufigsten A>G=C>U) und 3' Sequenz [[84]]. Adenin wird am meisten in der 5'-Position für die höchste Durchlesung bevorzugt, während Cytosin in der 3'-Position wie UGA-C in allen TRID-Studien 3-6-mal wirksamer ist, obwohl die optimale nachfolgende Reihenfolge der Basen TRID-abhängig ist [84, 85, 86, 87]. Interessanterweise übt die Base unmittelbar nach dem Stop-Codon den stärksten Einfluss auf die Durchleseeffizienz aus, da mRNA mit Freisetzungsfaktoren zur Beendigung der Translation [[84],[88]]. Computermodelle haben gezeigt, dass PTC124 aufgrund einer günstigeren Bindungsenergie als UAG- oder UAA-Stop-Codons eine Präferenz für UGA-Readthrough hat [[89]]. Darüber hinaus wird die PTC124-Durchleseeffizienz wie zuvor beschrieben in ähnlicher Weise durch den Kontext des PTC beeinflusst, wobei bevorzugt mit Adenin vor dem PTC und Cytosin unmittelbar nach dem PTC interagiert wird [[89]]. Weitere Studien sind erforderlich, um die Auswirkungen unterschiedlicher PTC-Kontexte auf die Durchleseeffizienz von Amlexanox zu bewerten. Die BBS2Y24*/R275*-Patientenmutationen stellen ein UAG bzw. UGA dar, aber beide werden nicht von optimalen Nukleotiden flankiert. Die ALMS1S1645*/S1645* Patient beherbergt zwei UAA-Stop-Codons und ist an den Enden von 5' bzw. 3' von Thymin und Guanin umgeben. Da sich die Wiederherstellung des Proteins weder statistisch zwischen den Medikamenten noch zwischen den beiden Krankheitsmodellen unterschied, deutet dies darauf hin, dass die Medikamente keine vorhersehbare Präferenz haben.

Diese Studie liefert einen Proof-of-Concept für die klinische Anwendung von TRIDs bei Ziliopathien. PTC124 ist derzeit für die orale Verabreichung dreimal täglich in einer empfohlenen Dosis von 10 mg/kg morgens und mittags und 20 mg/kg abends optimiert. Die häufigsten Nebenwirkungen, die mehr als 5 von 100 Behandelten betreffen, sind Erbrechen, Durchfall, Übelkeit, Kopfschmerzen und Blähungen. Es wurden keine schwerwiegenden unerwünschten Ereignisse festgestellt, wobei über 150 Patienten über zehn Jahre und weitere 180 über fünf Jahre überwacht wurden. Daher kann diese Form der Verabreichung besonders vorteilhaft für syndromale Erkrankungen mit mehreren Krankheitszielen sein, wie sie bei Ziliopathien beobachtet werden. Die Bioverfügbarkeit bestimmter Gewebe wie der Netzhaut kann eine lokale Abgabe erfordern, um die Blut-Netzhaut-Schranke durch intravitreale oder subretinale Injektion zu umgehen, obwohl bei den meisten Patienten mit bestehender Netzhautdegeneration diese Grenze geschwächt ist. Die START-Formulierung (0,9% Natriumchlorid, 1% Tween 80, 1% PTC124-Pulver und 1% Carboxymethylcellulose) verbesserte die Abgabe von PTC124 an die Netzhaut und Hornhaut der Maus [[90]], wurde dies jedoch noch nicht an Tieren oder Patienten höherer Ordnung getestet. Eine kürzlich durchgeführte klinische Phase-II-Studie zur Sicherheit und Wirksamkeit von PTC124 zur Behandlung von Nonsense-vermittelter Aniridie (NCT02647359) konnte das primäre Endpunktmaß einer Änderung der maximalen Lesegeschwindigkeit gegenüber dem Ausgangswert mit beiden Augen nicht erfüllen (unter Verwendung der MNREAD-Acuity Charts) [[91]]. Weitere Analysen der sekundären Endpunkte sind im Gange, aber dies unterstreicht auch die Notwendigkeit, sicherzustellen, dass die richtigen klinischen Ergebnismetriken für Studienmaßnahmen ausgewählt werden. Dies kann bei Ziliopathien aufgrund der weit verbreiteten Genexpressionsmuster und multisystemischen Merkmale einfacher sein.

Unsere Daten deuten darauf hin, dass TRIDs ein geeigneter therapeutischer Ansatz für Nonsense-Mutation-assoziierte Ciliopathien sein könnten. TRIDs wurden weitgehend zur Behandlung von Krankheiten wie der Duchenne-Muskeldystrophie mit einer starken Genotyp-Phänotyp-Korrelation mit dem schwersten Phänotyp im Zusammenhang mit Nonsense-Varianten eingesetzt [[92]]. Sowohl BBS als auch AS fehlen klare Genotyp-Phänotyp-Korrelationen, daher sind weitere In-vivo-Studien erforderlich, um die Sicherheit und systemische Wirksamkeit der TRID-Behandlung bei einer Reihe von Phänotypen, die mit beiden Ziliopathien assoziiert sind, vor der Translation in klinische Studien zu bewerten. Tiermodelle von Nonsense-assoziierten BBS und AS wie Bbs2-, Bbs4-, Alms1- und Almosen1-Nullmäuseund Zebrafische wurden bereits berichtet und können für zukünftige Studien verwendet werden [[93],[94]] Die Wiederherstellung der Proteine BBS2 und ALMS1 in voller Länge und die Korrektur sowohl anatomischer als auch funktioneller Ziliardefekte, die in unserer Proof-of-Concept-Studie berichtet wurden, sind ein immenses Versprechen für die zukünftige Ciliopathieforschung und vor allem für die von diesen Syndromen betroffenen Patienten.

Quelle: Scienedirect 

In dieser Publikation, welche aus nur einem Bild besteht ist eine multimodale Bidgebund verwendet worden,
um einen Patienten aus Portugal (unbekannt) abzulichten.
Multimodale Bildgebung kann die Netzhaut in bisher unerreichtem Detail abbilden, und die  Analyse  dieser Daten ermöglicht nicht nur die Sicherung von Diagnosen, sondern auch deren Präzisierung.  Automatische Bildverarbeitung und Auswertung schöpft das  volle Potenzial der vorliegenden Daten aus.

Neues aus Japan - ein Geschwisterpaar wurde als erste asiatische Patienten mit HJMD in diesem klinischen Report 
publiziert.
zum Artikel (externer Link)

Beschrieben wird der Fall einer männlichen Person mittleren Alters und der Familie mit Kindern.
Unter Publikation hinterlegt (Passwort geschützt - Anfragen per Email).
Direktlink: Hypotrichosis with Juvenile Macular Dystrophy in Saudi Arabia: A Case Report - PubMed (nih.gov)

Neuer Artikel über PTC124 und das Überlesen von Nonsense Mutationen:
externe Quelle:
Translational Read-Through Therapy of RPGR Nonsense Mutations

Ein Kontakt aus Italien bestätigte sich als HJMD Betroffener.
Der Mann mittleren Alters, wurde durch unsere Webseite zu seiner Erkrankung auf uns aufmerksam und wir stehen nun in persönlichem Kontakt. Immer wieder ein kleines Wunder, wie sich diese Stecknadeln im Heuhaufen finden. 

HJMD Krankheitsbeschreibung der Uniklinik Saarland (externer Link)

Schöne gelungene Krankheitsbeschreibung auf der Webseite der Saarland Unikinik.
Bei den Quellen wurden wir sogar gelistet - das ist sehr schön,
wenn die Seite HJMD dazu beiträgt, solch eine seltene Erkrankung bekannter zu machen.
Deswegen machen wir das hier !

Abstract

Introduction: Hair follicles are produced in a cyclical manner and the machinery involved in the reproduction of these follicles is present since the fetal stage. Although extensive research has been done on the human hair follicle, very little is known about the importance of adhesion molecules in its development.

Material and methods: We analyzed here, the immunoexpression of beta-1 integrin, p-cadherin, e-cadherin, and beta-catenin in hair follicles from 26 formalin-fixed and paraffin-embedded skin samples from human embryos and fetus between 12-23 weeks of gestational age.

Results: The adhesion molecules beta-1 integrin and e-cadherin/p-cadherin were expressed from 12 weeks and seemed to play a role in regulating epidermis invagination. Beta-catenin immunostaining was negative in all cases; down regulation of this protein may be necessary for fetal hair development and thus facilitating hair follicle down growth.

Discussion/conclusion: Adhesion molecules are essential for hair follicle down growth and proliferation; integrins and cadherins play a major role in this process. More studies are needed to describe hair follicle development.

zum Beitrag (extern)

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